菌株的保藏方法

1.載體保存法：即將微生物吸附在適當載體上進行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下幾種，如

① 土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌種的保藏。方法是在滅菌的土壤中加入菌液，立即在室溫下進行干燥或使菌體繁殖后再干燥，然后冷藏或在室溫下密封保存。保存用的土壤原則上以肥沃的耕土為宜，土壤需風干、粉碎、過篩和滅菌。

使微生物在土壤中繁殖后進行干燥保存的方法是：取適量土壤（5克）置于塞有棉塞的試管中，加水或加入充分稀釋的液體培養(yǎng)基（以含水量為土壤大持水量的60%為宜），然后高壓滅菌。再將需保存的微生物進行大量接種，培養(yǎng)至菌絲能用肉眼確認的程度為止，移入干燥器中經(jīng)短時間干燥或風干后密封，冷藏或室溫保存。

② 砂土保存法：取清潔的砂，過60目篩去掉大砂粒，并用磁鐵吸去砂中鐵屑，再用NaOH溶液、10% HCl溶液和水交替清洗數(shù)次，干燥后，置于試管或安瓶管中保持2～3cm深，再經(jīng)干熱滅菌后，加入1ml菌種培養(yǎng)液，經(jīng)充分混勻后，放入真空干燥器中，*干燥后熔封保存。也可用二份洗凈的砂（經(jīng)HCl預(yù)處理）和一份貧瘠、過篩的黃土攙和后滅菌，再進行菌種保藏。

③ 硅膠保存法：以6～16目的無色硅膠代替砂子，干熱滅菌后，加入菌液。加菌液時，由于硅膠的吸附熱常使溫度升高，因而需設(shè)法加以冷卻。

④ 磁珠保存法：將菌液浸入素燒磁珠（或多孔玻璃珠）后再進行干燥保存的一種方法。在螺旋口試管中裝入1/2管高的硅膠（或無水CaSO4），上鋪玻璃棉，再放上10～20粒磁珠，經(jīng)干熱滅菌后，接入菌懸液，后冷藏、室溫保藏或減壓干燥后密封保藏。本法對酵母菌很有效，特別適用于根瘤菌，可保存長達兩年半時間。

⑤ 麩皮保存法：在麩皮內(nèi)加入60%的水，經(jīng)滅菌后接種培養(yǎng)，后干燥保藏。

⑥ 紙片（濾紙）保存法：將滅菌紙片浸入培養(yǎng)液或菌懸液中，常壓或減壓干燥后，置于裝有干燥劑的容器內(nèi)進行保存。

2.

冷凍保存法：適用于抗凍力強的微生物。這些微生物可在其菌體細胞外遭受凍結(jié)的情況下而不受損傷，而對其它大多數(shù)微生物而言，無論在細胞外凍結(jié)還是在細胞內(nèi)凍結(jié)，都會對菌體造成損傷，因此當采用這種保藏方法時，應(yīng)注意以下幾點，

① 要選擇適于冷凍干燥的菌齡細胞；

② 要選擇適宜的培養(yǎng)基，因為某些微生物對冷凍的抵抗力，常隨培養(yǎng)基成分的變化而顯示出巨大差異；

③ 要選擇合適的菌液濃度，通常菌液濃度越高，生存率越高，保存期也越長；

④ 在菌液內(nèi)不添加電解質(zhì)（如食鹽等）；

⑤ 可在菌液內(nèi)添加甘油等保護劑，以防止在冷凍過程中出現(xiàn)菌體大量死亡的現(xiàn)象。同樣，也可添加各種糖類、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護效果的溶劑，但對有些微生物而言，不加保護劑時更有效。

⑥ 原則上應(yīng)盡快進行冷凍處理，但當加入保護劑時，可靜置一段時間后再進行處理。

⑦ 就動物細胞而言，應(yīng)在－20℃范圍內(nèi)以1℃/min左右的速度緩慢降溫，此后必須盡快降到貯藏溫度；而對絕大多數(shù)微生物而言，則不必如此，如結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的原蟲則可在－35℃范圍內(nèi)進行緩慢降溫，而噬菌體則必需采用上述的二階段法進行冷凍；

⑧ 若進行長期保存，則貯藏溫度越低越好；

⑨ 取用冷凍保存的菌種時，應(yīng)采取速融措施，即在35～40℃溫水中輕輕振蕩使之迅速融解。而就厭氧菌來說，則應(yīng)選擇靜置融化的措施。當冷凍菌融化后，應(yīng)盡量避免再次冷凍，否則菌體的存活率將顯著下降。

3.傳代保存法：有些微生物當遇到冷凍或干燥等處理時，會很快死亡，因此在這種情況下，只能求助于傳代培養(yǎng)保存法。傳代培養(yǎng)就是要定期地進行菌種轉(zhuǎn)接、培養(yǎng)后再保存，它是基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生產(chǎn)菌種的保存。

傳代保存時，培養(yǎng)基的濃度不宜過高，營養(yǎng)成分不宜過于豐富，尤其是碳水化合物的濃度應(yīng)在可能的范圍內(nèi)盡量降低。培養(yǎng)溫度通常以稍低于適生長溫度為好。若為產(chǎn)酸菌種，則應(yīng)在培養(yǎng)基中添加少量碳酸鈣。

一般地，大多數(shù)菌種的保藏溫度以5℃為好，像厭氧菌、霍亂弧菌及部分病原真菌等微生物菌種則可以使用37℃進行保存，而蕈類等大型食用菌的菌種則可以室溫直接保存。

傳代培養(yǎng)保存法雖然簡便，但其缺點也很明顯，如：①菌種管棉塞經(jīng)常容易發(fā)霉；②菌株的遺傳性狀容易發(fā)生變異；③反復(fù)傳代時，菌株的病原性、形成生理活性物質(zhì)的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期轉(zhuǎn)種，工作量大；⑤雜菌的污染機會較多。          

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